＃發行日期：1991、10
＃期號：0262
＃專欄：「分子流行病學」專輯
＃標題：環境的守護神──環境與職業監視的分子流行病學
＃作者：劉紹興
．表一：日常環境中的基因毒物
．表二：工作場所的致癌物及高暴露人口群
．圖一：基因毒物在體內的代謝情形及基因毒性過程
．圖二：安姆氏簡速生物測定法的步驟
．圖三：苯
代謝成最終致癌物，再與DNA形成結合物。
．圖四：染色體異常的顯微鏡照片
．圖五：姊妹染色分體交換的顯微鏡照片
．圖六：小核（M）的顯微鏡照片
環境的守護神──環境與職業監視的分子流行病學
人類自出生以後即不斷暴露於各種不同的自然或合成物質中，這些物質約可概分為物理性及化學性物質。前者如紫外線、宇宙射線或熱等；後者如空氣污染物、農藥或食品添加物等，出現於日常環境或食物中的天然或合成物。就業以後，在工作場所亦會接觸各種生物、物理和化學性的工業毒物。
時至今日，我們了解其中部分物質除了影響我們的基因外，它們很可能在人類的演化與突變上，也扮演了重要的角色。近年來，由於科技不斷的成長和人們追求更舒適的生活，許多新的天然或合成物質源源不斷湧進我們生活的周遭。無可置疑的，對這些物質做生物危害評估，並了解其是否具有基因潛在的毒性，是極為重要的。
體外實驗和動物試驗，是認定基因毒性物質的方法，但新物質太多無法一一測試，而且體外實驗或動物試驗不足以預測一個人對環境或職業暴露的反應。因此危險評估時流行病學的方法是不可或缺的。
長期觀察暴露於某種物質的人群，估計疾病或癌症的發生頻率，是常用的危害評估流行病學方法。但疾病或癌症往往在暴露後的數年或數十年才發生，萬一此時發現某種物質是有害的，那已是太晚了。石棉用在工業和家庭中就是個例子，等到發現石棉是一種危險的致癌物後，它已大量使用了幾十年，暴露的人口何止千萬，致使石棉造成的疾病日趨增加之中。
因此，為有效預防不明毒性的物質流入我們的生活中，必須有比疾病發生更早期的方法來監視接觸不明毒性物的人們，出現早期的基因傷害時即要設法防範，而不必等到疾病發生時才來禁用某些毒物。由於致癌物的主要作用部位在DNA，且大部分的致癌物為基因毒物，因此用來監視環境或職業致癌物暴露的方法，大多集中於細胞內的基因物質，故稱之為「分子流行病學」（molecular epidemiology）。
日常環境中可能接觸的基因毒物列於表一。表列基因毒物的分類，是依據國際癌症研究中心（IARC）的分類標準。a.表示已經確定的人類致癌物；b.表示可能的人類的致癌物；c.表示不屬於a和b，但動物的致癌性已經確定。環境中基因毒物的來源有食物、水、空氣和住家環境，以及個人的習慣如飲酒和抽煙。其中最大的來源是酒精、食物的成分、香煙、室內空氣污染和飲水。
工作場所中可能接觸到的基因毒物列於表二，表中亦列出高暴露的工作者。一般而言，職業工作環境中的暴露遠大於一般環境中的暴露，其間的差異亦因基因毒物之不同而不同。例如甲醛亦存在家庭中的三夾板中，或室內空氣中亦存在高的多環類芳香烴，因此職業環境比一般的高十倍，但石棉在工廠中的暴露比一般環境中高達10,000倍。
因此，一般人在日常生活中或多或少均會接觸某種基因毒物，只是這些毒物的量不會太高，以至於超過個體的忍受劑量。假如致癌作用沒有最低量的閾限值（threshold），那人類的一生就無法倖免於癌症；也就是說，如果不因其他原因而死亡的話，那最後必定死於癌症。
致癌物或致突變物一般可分為兩種：一是直接作用的致癌，它不需經過反應就可直接與基因作用；二是致癌前物，它需經過代謝反應才能產生具活性的最終致癌物質（見圖一）。前者有燻煙劑二溴乙烯（EDB）和尿布防火劑二溴丙烷磷酸（Tris）。而大部分的致癌物屬於後者，例如氯乙烯、苯、
胺和亞硝酸胺等。
一般認為DNA是致癌過程中的目標，因此基因毒物是指會與DNA反應而產生破壞作用者。致癌物本身或其活性代謝物，最後與基因物質（DNA）結合在一起。此結合反應是由於最終致癌物產生嗜電子性的基團，它很容易與核酸中嗜核性的部位利用共價鍵結合在一起，形成致癌物──DNA結合物（adducts）。嗜核性的部位在核酸中有N7-鳥嘌呤、N3和N1-腺嘌呤或O6-鳥嘌呤等。在蛋白質中亦有嗜核性部位，例如N1-組胺酸、S-半胱胺酸和N-纈胺酸，因此活性的最終致癌物亦可與蛋白質結合形成致癌物-蛋白質結合物。
雖然致癌物進入人體後，可能被代謝成嗜電子性的最終致癌物而與DNA結合產生作用，但人體亦有防衛機轉來避免致癌物與DNA結合。哺乳類有兩種酵素系統來清除被代謝的嗜電子性產物：一是麩胺基硫轉換
（S-glutathione
transferase），另一個是氧化基水解（epoxide hydratase）。麩胺基硫轉換把嗜電子性物質與麩胺基硫結合，再經過一系列
的作用，轉變成膀胱酸或馬尿酸而從尿中排除。氧化基水解則把氧化基水解成雙醇類（diols），例如苯氧化基被水解成苯雙醇。因此這兩種酵素都是把活性的產物去活性而達到解毒的效果。
人體另一個防禦機轉是利用修補酵素把DNA上的結合物切斷，因而被切斷的核酸從尿液中排出。如果有結合物的DNA無法修補，那細胞分裂時可能造成複製的錯誤，因而形成複製的基因與原來的不相同，這就是突變。導致突變的基因改變有大也有小，小的突變（micromutation）可能是失去或增加一個或數個核
酸（構形改變突變），或核酸被另一個核酸取代（基對取代突變）。大的突變（macromutation）則造成可看得見的染色體改變，例如染色體數目的改變或染色體結構的異常（如染色體斷裂或重組）。這種在顯微鏡可看到異常的研究，稱之為「細胞基因研究」。
根據前述致癌物進入人體後的一連串反應，欲了解某種可能的致癌物進入人體的量，或人體吸收後對基因的影響，那可利用各種方法監視致癌物進入人體後的變化，這就是分子流行病學探討的範圍。目前分子流行學上應用的生物監視方法，可概分為三類：一、測量致癌物本身或其代謝物在人體體液中的量，如血液、尿液或呼氣中的致癌物濃度；二、測量人體體液中致癌物與嗜核性物質結合的量；三、測量致癌物導致的突變作用。
測量體液中致癌物的量
第一類測量致癌物在人體體液的量，它代表致癌物吸收至體內或某特殊器官的總量，但它無法反應出人體內的代謝（活化或去毒）、分布和排除作用。這種測量方法又分為選擇性和非選擇性兩種。所謂選擇性方法是，測量某特殊物質或其代謝物在人體體液的量，例如測量血中砷或鉻的濃度、尿液中苯的濃度，或測量尿中苯的代謝物酚的濃度，或測量尿中氯乙烯的代謝物──thiodiglycollic acid──的量。
所謂非選擇性方法是測量所有尿中的致癌物或致突變物，而並非單單測量某種特殊物質。這種方法測量所有由呼吸道、腸胃道或皮膚吸收進入人體，而經由尿液排泄出來的致突變物質總量。目前常用的方法是尿液安姆氏測定法（Ames test，見圖二）。安姆氏測定法是，利用在組胺酸位置產生突變的沙門氏菌種（Salmonella typhimuriu），它在缺乏組胺酸的培養基中，因不能繼續合成蛋白質而不能生存。如果尿液中有致突變物存在的話，這些菌種能在含有構形改變或基對取代致突變物中，很敏感地產生逆突變，逆突變菌種有正確的核
酸次序得以正確合成蛋白質，因此在含微量組胺酸的培養基中亦能生長形成菌落，計算菌落的數目可反應出尿液中致突變物的量。
致癌前物需要經過代謝作用才能產生最終致癌物，因此，測定致突變性時要加入代謝作用所需的，才能反應出致癌物和致癌前物的總量。測定時加入的大多來自老鼠的肝臟，老鼠先注射多氯聯苯或巴比妥鹽類以刺激代謝的增加，五天後將老鼠肝臟取出，打碎後在9000倍重力下離心，其上的清液即存在著，故稱之為S-9。另外，有些致癌物經過代謝後與尿甘酸結合成尿甘酸化物（glucuronide）而從尿液排出，這是解毒的作用，尿甘酸化物一般都不具致突變作用。因此要測量其結合前的致癌物，在試驗中需加入尿甘酸化物酵素（β-glucuronidase）。
測量致癌物-結合物的濃度
第二類測量體液中與嗜核性物質結合的致癌物量，它代表人體吸收致癌物後，真正到達作用部位（DNA或蛋白質）的量。因此它的測量值又稱為「生物有效劑量」（biological effective dose）。由於DNA是基因毒物的作用部位，目前的方法多測量致癌物-結合物的濃度。測量結合物濃度時需具備幾個條件：一、萃取細胞中的DNA；二、敏感的測量方法；三、特異性高的測量方法。細胞中的DNA很微量，測量時需要10∼100微毫克的DNA，這相當於0.2∼1公克的組織或25∼50毫升血液中白血球萃取出來的DNA量。因此組織或血液標本要夠多，才能得到所需DNA的量，這也是此種方法的一個缺點。
目前測量結合物有三種很敏感的方法：磷-32後標示法（32P-postlabelling）、酵素免疫分析法（enzyme
immunoassays, EIAs）和螢光譜（fluorometry）方法。這三種方法都很敏感，測定的範圍都在pg（10-12公克）至fg（10-15公克）的程度，也就是106∼107個核酸中有一個結合物就可測出。
目前分子流行病學上應用這種方法測定的致癌物有苯
靁（見圖三）、黃麴毒素、烷基化亞硝酸胺和硝基芘（nitropyrene）。前兩種方法因簡單迅速且不需貴重儀器，頗受目前研究者歡迎，但其缺點是專一性不夠，可能與其他化合物呈交互作用，例如苯-DNA結合物的測定值中，可能含有其他多環類芳香烴與DNA的結合物，而不是單單只有苯。這也是目前各實驗室研究的主要方向，以尋求專一性較高的方法，那測定的量就更可靠了。
測量致癌物導致的突變作用
第三類測量致癌物導致的突變作用，它代表人體暴露於致癌物後體內所產生的生物效應，但這種效應目前尚不認為是健康不良的效應。這類的突變測量方法在測量小突變的方法有HGPRT、 GPA和HLA-A基因的突變；測量大突變的方法有染色體異常（chromosome aberration， CA；見圖四）、姊妹染色分體交換（sister chromatid exchange﹐ SCE；見圖五）、小核（micronucleus﹐MN；見圖六）和染色體數目異常（aneuploidy）。
基因突變的測定目前正在發展之中，應用的範圍不是很多，故其生物學上的意義尚在研究。目前應用較廣的是所謂細胞基因方法，即CA、 SCE和MN。
這三種方法都要利用細胞培養，使細胞在刺激劑的作用下產生複製和分裂，再利用染色的方法以顯微鏡計數染色體的異常情形。染色體異常（CA）是指染色體在結構上的異常，例如斷裂、交換或重組的變化。一般都觀察第一代複製染色體的結構。姊妹染色分體交換（SCE）則利用特殊染色方法觀察第二代複製細胞的染色體交換情形。小核（MN）則觀察斷裂的染色體，在細胞複製過程中殘留在細胞核內的殘餘物。因此，細胞基因方法是利用肉眼去觀察染色體的異常，所以常會因觀察的人不同而導致不同的觀察結果，這是使用時要特別小心的地方。
以下我們以多環類芳香烴（polycyclic aromatic hydrocaroons, PAHs）為例，說明分子流行病學應用的方法。多環類芳香烴是環境或職業中經常接觸的物質，含有碳或氫的物質經由高溫或燃燒反應就可以產生多種的PAH。例如香煙、稻草或木材的燃燒，汽車燃燒排出的廢氣，煉鋼工廠煤焦爐排出的廢氣，石油煉製工廠，金屬鑄造廠或火力發電廠等，均因高溫作用而產生PAHs。因此，多環類芳香烴的暴露人人都有可能，只是暴露量多少的差別而已。
如果我們想知道煉焦爐工人多環類芳香烴的暴露情形，及因暴露而造成工人體內的生物效應，那分子流行病學可收集這些工人的體液或細胞來測量。由於人體的研究，首先要考慮到收集那些體液或細胞來測量。
由於多環類芳香烴的致癌器官是肺部，因此如果能夠收集到肺部的細胞或組織是最好的。但肺部標本的收集不容易，必須利用支氣管鏡深入肺部來取得標本，這種侵犯性的檢查不易讓一般人接受。因此退而求其次，選擇血液中的白血球來測量。利用白血球來代替肺部組織細胞，雖然是間接的，但沈積於肺部的PAHs最後也吸收至血液中，因此血液中的白血球可用來代替肺部組織的細胞。
另一個問題是煉焦爐工人的測量值是高還是低，必須找一些正常人來做比較，這就是所謂的對照組。因此同時收集暴露工人和對照組工人的體液標本來測量，就可以知道煉焦爐工人與一般人比較時的差異。
應用分子流行病學方法，我們可測量上述兩組人：一、尿液或血液中PAH的濃度；二、尿液致突變性試驗；三、血液白血球中苯-DNA結合物濃度；四、血液白血球的基因突變；五、血液白血球的細胞基因研究，如染色體異常、姊妹染色分體交換或小核等。
如此的測量，一、可以回答這些人因環境或職業的暴露，吸收多少量的PAH或各種PAH的量是多少。雖然可以定量，但各種PAH的致突變能力有程度的不同，因此二、可以回答尿液中所有PAH的總和致突變性的能力。這些吸收到體內的PAH，部分經由代謝作用變成無毒的產物而由尿液排除，只有少部分真正存留在體內而與作用部位（DNA）結合在一起，因此三、可以回答有多少苯真正與DNA結合而可能產生基因毒性。
結合物的濃度決定於個人體內解毒酵素、活化酵素以及基因修補酵素的多寡。暴露等量PAH的兩個人，如果修補能力均相同，那解毒酵素多且活化酵素少的人，其結合物會較少；相反的，解毒酵素少且活化酵素多，那結合物形成就多。如果暴露和解毒或活化能力均相同，那修補能力強的人其結合物少，而修補能力差的人則結合物多。因此，四、測量苯-DNA結合物，代表了個體的活化酵素、解毒酵素和修補酵素的總反應。這也說明同樣抽煙的人，其體內的苯-DNA結合物會有很大的差異。
有苯-DNA結合物或其他結合物存在時，會擾亂細胞的複製造成突變，但突變的基因可能被修補，或突變的細胞因基因受損嚴重無法生存，因此五、利用細胞培養的方法，選擇可存活的細胞來觀察其複製後造成的結果。雖然除了骨髓和少數細胞外，正常人體細胞不會進行有絲分裂，這種細胞基因的觀察，反應體細胞對毒物承受的傷害及其修補能力的總和。同樣多的基因傷害，修補能力強亦不會造成嚴重的染色體異常。相反的，修補能力差或根本缺乏修補能力，那就容易出現異常現象。
上面的例子說明利用一系列分子流行病學方法，來了解暴露於某種致癌物之人口群的體內吸收量、體內有效劑量和體內生物效應。但這些測量方法只是探討與暴露的關係，它們並不意謂著健康效應，即癌症的發生。致癌的機轉尚在摸索之中，由細胞基因傷害到發展成癌細胞中間，還有許多不明的變化，且需經過一段很長的時間。因此，目前想把分子流行病學與癌症流行病學連在一起，尚有許多困難。這也是目前分子生物學家一直想突破的地方，了解更多的致癌機轉，才能發明更新的分子流行病學方法應用於人類，其最終目標是從現階段的早期診斷和早期治療，向前推進到預防過度暴露，使人類免於談癌色變的恐懼。
日常環境中或工作場所存在有許多基因毒物，為求避免減少暴露，可應用分子流行病學方法監視可能暴露的人口群。目前應用的方法包括：一、測量體內吸收量，如測量致癌物本身或其代謝物濃度和安姆氏測定法；二、測量體內有效生物劑量，如測量致癌物與DNA結合物的濃度；三、測量基因突變，如HGPRT基因的微小突變，和染色體異常、姊妹染色分體交換及小核等大突變。這些方法的測量結果，可了解某種物質暴露的程度，但它的結果並不表示對健康的影響。
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